Desarrollo de un kit para el diagnóstico diferencial y rápido de la coriza infecciosa y el síndrome de cabeza hinchada en la industria avícola

RESUMEN DEL PROYECTO
El síndrome de cabeza hinchada (SCH) y coriza infecciosa (CI) constituyen dos de las infecciones respiratorias más importantes en la industria avícola peruana que generan alta morbilidad. Ambas enfermedades presentan signos clínicos similares dificultando su diferenciación, diagnóstico y tratamiento. Por esta razón, pruebas de diagnóstico rápido, específico y de bajo costo son una necesidad.
El objetivo de este proyecto fue desarrollar tiras inmunocromatográficas para el diagnóstico diferencial y rápido de CI y SCH, como una alternativa a los métodos de diagnósticos convencionales. Para ello, se identificaron proteínas candidatas en base a información genómica disponible y se seleccionaron péptidos inmunogénicos (secuencias de 14 aminoácidos) mediante herramientas bioinformáticas. Luego, se sintetizaron los péptidos para inmunizar conejos (New Zealand) y obtener anticuerpos policlonales. Para evaluar la reactividad y especificidad de estos
anticuerpos se realizaron pruebas de ensayos de inmunodetección y western blot (WB) teniendo como antígenos los lisados celulares o sobrenadantes de células infectadas con Avibacterium paragallinarum y Metapneumovirus aviar así como contra otros patógenos aviares.
Los péptidos inmunogénicos que dieron origen a anticuerpos policlonales con una correcta reactividad y especificidad, fueron empleados para inmunizar ratones BALB/c. Las células de bazo de los ratones fueron utilizadas para la generación de hibridomas y posterior selección de clonas productoras de anticuerpos monoclonales. Luego, estos anticuerpos fueron purificados y evaluados a través de ensayos de WB y ELISA. Finalmente, se diseñó un set de tiras inmunocromatográficas con aquellos Am que cumplieron los criterios de evaluación.
En condiciones de laboratorio el prototipo fue capaz de detectar la bacteria Av. paragallinarum utilizando el Am 1G7G8 sin presentar reactividad cruzada frente a Metapneumovirus aviar, brindando resultados entre 20-30 minutos de aplicada la muestra.

Resultados del proyecto
• Se seleccionaron 9 péptidos de la proteína “pseudogen_01342” (P01342) para Av. Paragallinarum; 3 péptidos de la proteína Matriz y 3 péptidos de la proteína de Fusión para Metapneumovirus aviar.

• Se obtuvieron anticuerpos policlonales utilizando los péptidos seleccionados. Sólo dos anticuerpos policlonales obtenidos de 2 péptidos fueron positivos para Av. Paragallinarum y solo 1 anticuerpo policlonal obtenido de 1 péptido fue positivo para Metapneumovirus aviar mediante Western blot.

• Se obtuvo anticuerpos monoclonales a partir de clonas de hibridomas usando los péptidos seleccionados. Sólo 1 (1G7G8) de 4 clonas fue positiva para Av. paragallinarum y sólo 1 (3A7B7) de 4 clonas fue positiva pero con baja reactividad para Metapneumovirus aviar.

• Se logró el desarrollo de un prototipo de prueba rápida de diagnóstico cualitativa (presencia o ausencia), empleando anticuerpos monoclonales de la clona 1G7G8, demostrando ser específico para Av. paragallinarum frente a muestras de Metapneumovirus aviar, Ornithobacterium rhinotracheale y Escherichia coli.

ESTADO
Terminado 26/08/2017